• 欧洲型PRRSV重组腺病毒疫苗的构建效果评价 不要轻易放弃。学习成长的路上,我们长路漫漫,只因学无止境。


      猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive andrespiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome Virus,PRRSV)引起的猪繁殖与呼吸系统疾病。目前该病在全球范围广泛流行,严重影响养猪业的健康发展。目前根据PRRSV 基因型和抗原性差异可分为2个基因型,分别是欧洲型(基因Ⅰ型,代表株为LV 株)和美洲型(基因Ⅱ型,代表株为VR-2332)。一直以来,我国主要流行株为美洲型及其变异株,但如今欧洲型PRRSV 的流行已经打破了地域的限制,近年来相继在福建,香港、内蒙古等地分离到欧洲型PRRSV。而该病曾在欧洲大规模流行,对养猪业造成严重损失,因此对欧洲型PRRSV 的预防显得愈加重要。目前防控欧洲型PRRSV感染的商品化疫苗仅有灭活疫苗,但其免疫效果不十分理想,只能提供部分保护,不能预防感染。因此凾待研发一种新型有效的疫苗。

      腺病毒载体在基因治疗和疫苗生产中显示了较好的应用前景,其具有宿主范围广,病毒滴度高,可插入较大的外源基因片段且不整合到宿主基因组等特点,是一种应用广泛的基因治疗载体。本研究以欧洲PRRSV LV株ORF3、ORF5基因为对象,以人腺病毒五型为载体,构建重组腺病毒,并通过小鼠试验评价其免疫原性。

      材料与方法

      1 材料

      1.1 基因、质粒及细胞株

      PRRSV LV 株ORF3、ORF5基因由上海捷瑞生物工程有限公司合成;人腺病毒五型野毒(Adenovirus 5 wild-type,Ad5-wt)、pacd5K-N pA 、pacad5 9.2-100质粒和HEK 293细胞由本室保存。

      1.2 试验动物

      BALB/c小鼠,雌性,6~8周龄,体重20~30g,共50只,购于吉林长春生物制品所。

      1.3 主要试剂

      Ex Taq DNA 聚合酶,DL2000Marker及各种限制性内切酶均购自于宝生物工程(大连)有限公司;大肠埃希菌DH5α感受态细胞购于北京全式金生物技术有限公司;硝酸纤维素膜购于美国Merck Millipore公司;小鼠抗LV 血清由本室保存;HRP标记山羊抗鼠二抗购于博士德生物工程有限公司;X-OMAT BT医用X射线胶片购于加拿大Carestream公司;转染试剂X-treme GENE HP购自瑞士Roche公司;DMEM 及胎牛血清购自美国HyClone公司;胶回收试剂盒和基因组DNA 提取试剂盒购自美国Axygen Biosciences公司;其它试剂均为国产分析纯。

      2 方法

      2.1 引物设计

      根据PRRSV LV 株ORF3、ORF5基因组序列,应用Prime 5.0设计6条引物,其中引物ORF3-R(W)中无终止密码子,引物ORF5-F(Linker)中含有自裂解linker序列。

      2.2 目的基因ORF3、ORF5的扩增

      以PUC-EUORF3、PUC-EU-ORF5质粒为模板,分别应用引物ORF3F/ORF3R和ORF5F/ORF5RPCR扩增ORF3和ORF5目的基因。应用ORF3/ORF5(W)引物扩增不含终止密码子的ORF3基因,应用ORF5-F(Linker)/ORF5R 引物扩增含有自裂解linker序列的ORF5基因,再以二者PCR 产物为模板,以ORF3/ORF5为引物进行重叠PCR。反应条件:94℃预变性5min;94℃变性30s,60 ℃退火30s,72 ℃延伸1min,72℃再延伸10min。将扩增片段连接至PMD-18TVector(于孵育器中16℃连接过夜),构建克隆质粒18T-EU-ORF3、18T--EU-ORF5 和18T-EUORF3-ORF5并转化至DH5α,而后小提质粒并测序。

      2.3 穿梭质粒的构建

      将构建的18T-EU-ORF3、18T-EU-ORF5和18T-EU-ORF3-ORF5分别与穿梭质粒pacad5K-N pa以BamHⅠ/XbaⅠ、XbaⅠ/NotⅠ、BamHⅠ/NotⅠ进行双酶切,然后在T4DNA 连接酶作用下连接、转化,小提质粒后酶切验证。

      2.4 质粒的共转染

      将构建的腺病毒穿梭质粒与骨架质粒用PacⅠ酶切线性化后,以2μg质粒与2μl Xtreme GENE DNA 转染试剂、200μl OPTI-MEM 混匀后共转染至80%的HEK 293单层细胞中,1h后补加10%DMEM,于37℃、5%CO2温箱中培养,收集出现细胞病变(CPE)的HEK 293细胞。

      2.5 重组腺病毒GP3、GP5、GP3-GP5 目的蛋白Western blot检测

      取80%病变的细胞离心,沉淀加入适量细胞裂解液后冰浴30min,再以6 000r/min(离心半径5.07cm)离心3min,取上清,与5×上样液混匀,置沸水浴10min,然后以12%分离胶进行SDSPAGE电泳,将胶片转印至硝酸纤维素膜,用5%脱脂乳室温封闭1h后加入小鼠抗LV抗体室温振荡孵育1h,TBST洗涤3次,每次8min;加入山羊抗小鼠二抗室温孵育1h,TBST洗涤3次,用显影液和定影液进行显影和定影,结果拍照保存。

      2.6 重组腺病毒的小鼠免疫试验

      2.6.1 小鼠分组与免疫

      将50只雌性BALB/c小鼠随机分成5组(rAd-EU-ORF3、rAd-EU-ORF5、rAd-EU-ORF3-ORF5、Ad5-wt、PBS),每组10只,采取腿部肌肉注射免疫,免疫剂量为5×107 PFU/100μl/只,21d后加强免疫一次。

      2.6.2 淋巴细胞增殖试验

      取2次免疫后14d的小鼠,无菌分离小鼠脾脏,研磨后按照试剂盒说明书进行小鼠脾淋巴细胞分离试验。分离的淋巴细胞用RPMI-2640调整细胞浓度为2×106 个/ml,于96孔细胞培养板每孔加50μl淋巴细胞(含1×105 个淋巴细胞),并分别加入50μl Con A、50μl(1MOI)PRRSV灭活病毒及50μl RPMI-1640作为非特异性刺激组、特异性刺激组与不加刺激物的对照组,同时设定空白对照组。于37℃、5%CO2培养箱培养72h,每孔加入10μl(5mg/ml)WST(提供中文对照)继续培养3h,用酶标仪在450nm 波长处检测A 值,计算刺激指数。刺激指数(SI)= (刺激孔A450值-空白对照孔A450)/("万博体育是靠谱的公司吗?博彩资讯平台,创办至今已经有三年左右的历史了,万博体育betx博彩娱乐平台是国内最人性化的一家娱乐平台,高铁40元盒饭发霉 欢迎您的加入为您打造安全,优质的服务,万博体育是靠谱的公司吗?PT老虎机下载极速、注册充值、免费试玩,体验高档的游戏! "对照孔A450值-空白对照孔A450值)。

      结 果

      1 PRRSV LV株ORF3、ORF5、ORF3-ORF5目的基因扩增产物鉴定

      PCR扩增目的片段经1%琼脂糖凝胶电泳检测大小分别为798、606和1 414bp,与预期值相符合。

      2 穿梭质粒pacad-EU-ORF3、pacad-EU-ORF5、pacad-EU-ORF3-ORF5酶切验证

      将构建的pacad-EU-ORF3以EcoRⅠ/XbaⅠ进行双酶切,目的片段为798bp,将pacad-EU-ORF5以XbaⅠ/NotⅠ进行双酶切,目的片段为606bp,将pacad-EU-ORF3-ORF5酶切验证以EcoRⅠ/NotⅠ进行双酶切,目的片段为1 414bp。均与预期结果相一致。

      3 重组腺病毒鉴定

      将线性化的质粒共同转染至HEK 293细胞后,每天观察细胞变化,共转染8~12d时,细胞出现变圆、间隙变大、细胞聚集现象,而对照组细胞正常,表明可能已经包装出重组腺病毒。

      4 重组腺病毒表达产物的Western blot检测

      当80%细胞出现CPE时,收获细胞及培养液,冻融3次,以5 000r/min离心10min,无菌收取上清,进行Western blot试验。结果显示,rAd-EU-ORF3表达的GP3蛋白约为30ku,对照组无此蛋白;rAd-EU-ORF5 表达的GP5 蛋白约为22ku;rAd-EUORF3-ORF5表达22ku和30ku蛋白。目的蛋白分子质量与预期结果相一致。

      5 淋巴细胞增殖试验结果

      淋巴细胞增殖试验显示用LV为抗原的特异性刺激组rAd-EU-ORF3、rAd-EU-ORF5、rAd-EU-ORF3-ORF5和PBS组SI指数分别为2.425、2.230"万博体育是靠谱的公司吗?博彩资讯平台,创办至今已经有三年左右的历史了,万博体育betx博彩娱乐平台是国内最人性化的一家娱乐平台,高铁40元盒饭发霉 欢迎您的加入为您打造安全,优质的服务,万博体育是靠谱的公司吗?PT老虎机下载极速、注册充值、免费试玩,体验高档的游戏! "、3.477和1.444,均是PBS组1.5倍以上,差异有统计学意义(P <0.05),且rAd-EU-ORF3-ORF5 组显著高于rAd-EU-ORF3组和rAd-EU-ORF5组;Con A组非特异性刺激组及对照组SI指数为1.907、1.575和1.763。

      讨 论

      PRRS于1987年在美国首次发现,该病引起母猪严重的繁殖障碍疾病,并在几年内迅速广泛传播于世界各地,而引起该病的病毒直至1991年在欧洲和美洲才被独立分离。PRRS的最主要特点是繁殖障碍疾病,病毒可透过胎盘屏障感染给胎儿,引起母猪流产和早产及幼仔的呼吸系统疾病。目前国内流行的主要是美洲型PRRSV 及其变异毒株,而对美洲型PRRSV的防控主要依靠弱毒疫苗和灭活疫苗。由于欧洲型PRRSV和美洲型PRRSV二者基因型核苷酸序列同源性仅为56~60%,且国内尚无针对欧洲型PRRSV的疫苗,使得欧洲型PRRSV 疫苗的研发愈加重要。

      PRRS结构蛋白和非结构蛋白共同组成其免疫原性蛋白,其中GP5蛋白和M 蛋白是主要结构蛋白,而GP5蛋白含有丰富的糖蛋白,可诱导机体产生中和抗体。同时GP3、GP4、GP5、M 蛋白存在潜在的T细胞表位。这对诱导产生有效的PRRSV抗体极为重要。基于此因素,为预防PRRSV的感染,人们致力于亚单位疫苗的研发。Chia等报道重组杆状病毒表达的GP3-GP5蛋白可对妊娠母猪提供68%的保护率。Jiang等以腺病毒为载体共表达的GP3-GP5,GP4-GP5,GP3-GP4-GP5免疫小鼠,结果均可刺激机体产生较高水平的抗体,但仅限于小鼠免疫实验。而以重组鸡痘病毒为载体,共表达IL-18-ORF5-ORF3,无论是中和抗体还是淋巴细胞增殖试验,均显示出较好的免疫原性。

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      本实验构建的重组腺病毒是将欧洲型PRRSV病毒ORF3、ORF5基因连接到穿梭质粒上,通过重组病毒分别表达GP3、GP5及共表达GP3-GP5蛋白,在实验设计上为防止GP3和GP5蛋白融合表达,在基因组ORF3和ORF5之间添加自裂解linker,使得GP3蛋白与GP5蛋白相互独立表达。对包装病毒表达产物进行western blot验证,显示重组病毒可稳定表达目的蛋白。用包装的病毒免疫小鼠,2次免疫14d后无菌分离脾淋巴细胞进行淋巴细胞增殖试验,显示出重组腺病毒能诱导淋巴细胞增殖,从而增强机体免疫应答水平,为PRRSV 病毒的感染预防提供了实验依据。

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